新生儿胃微生物群落早期微生物定植对其免疫系统的印记至关重要。母体微生物的垂直传播被认为是新生儿初始微生物定植的关键来源。我们旨在评估母体阴道和直肠微生物群在经阴道分娩和剖宫产新生儿早期胃微生物群落定植中的作用。
在分娩前不久收集了母体阴道和直肠拭子。在经阴道分娩（n = 23）和剖宫产（n = 40）新生儿（总共n = 63）中，在出生后第0天、第7天和第28天收集了新生儿粪便样本。所有样本均通过16S rRNA测序进行分析。比较了母体拭子与新生儿粪便样本之间共享的扩增子序列变异（ASVs）的相对丰度在经阴道分娩和剖宫产新生儿之间的差异。
母体直肠和阴道拭子与所有新生儿样本之间共享的ASVs的中位相对丰度较低（对于直肠或阴道拭子与任何三个时间点，均低于10%）。当关注经阴道分娩与剖宫产新生儿时，与母体阴道拭子共享的ASVs的相对丰度没有差异，仅在第7天的直肠拭子中存在差异（p = 0.002）。然而，在两种分娩方式中，与母体直肠拭子共享的ASVs的相对丰度较高（经阴道分娩新生儿为19%，剖宫产新生儿为2%），而与母体阴道拭子共享的ASVs的相对丰度在第28天均为0%。
我们观察到只有少量的ASVs从母体直肠和阴道部位转移到新生儿胃微生物群落。来自母体胃微生物群落的ASVs对新生儿微生物群落定植的贡献大于来自母体生殖道的ASVs，在一个月大时更为显著。我们的发现有助于更好地理解影响新生儿胃微生物群落定植的因素，这对了解早期定植特征与后期生命健康结果的关系具有重要意义。
人类微生物群落微生物群包含约10^13-10^14个微生物，包括细菌、病毒和真菌[1]。新生儿定植被认为始于分娩过程中母亲向后代的垂直传播，随后在生命的最初几天和几周内通过非遗传方式进行水平传播。初始定植的特征可以不同，并影响胃微生物群落的正常发育和免疫系统的印记[2]。例如通过剖宫产和/或抗生素破坏正常的定植过程，先前已被认为会增加肥胖、过敏、哮喘和炎症性肠病等疾病的风险，这些风险可能持续整个生命过程[2, 3]。经阴道分娩和剖宫产新生儿的产后定植取决于多种环境因素，如喂养方法（母乳喂养或配方奶）、父母和同龄人的暴露以及药物（特别是抗生素）的暴露[4,5,6]。
经阴道分娩（VB）的新生儿最初主要接触母体阴道和会阴部的微生物，而剖宫产新生儿则不受这一生理过程的影响，主要接触母亲皮肤上的微生物[7]。先前的研究表明，相应地，经阴道分娩的新生儿显示出以 Lactobacillus 和 Bifidobacterium 为主的微生物群落优势，可能是从其母亲那里传递来的[7]。相比之下，剖宫产（CS）新生儿表现出异常的微生物群落微生物定植，甚至在第一年以后，与经阴道分娩的新生儿相比， Bacteroides 物种的丰度降低[8,9,10]。有研究观察到，剖宫产出生的后代在两岁时的微生物多样性仍然低于经阴道分娩的新生儿[9, 10]。
母体会阴、直肠和阴道来源的微生物垂直传播到新生儿胃微生物群落的确切机制尚不清楚。最近的研究表明，尽管母体阴道微生物群中 Lactobacillus 的相对丰度很高，但来自母体直肠来源的其他微生物的传播可能在垂直传播中起更重要的作用[5, 11]。详细了解这些机制可以改善对新生儿微生物群落微生物群定植发展的理解，并可能导致开发新的基于微生物群的策略来预防或解决早期生态失调，这与负面健康结果相关，甚至超出婴儿期。
本研究的目的是评估母体阴道和直肠微生物群如何在经阴道分娩和剖宫产新生儿中定植新生儿胃微生物群落。
本研究是一项回顾性队列研究。本研究纳入了之前一项随机对照试验中的63对母婴[12]。之前研究的目的是评估剖宫产时预防性抗生素使用时机（在皮肤切口前给予母亲静脉注射头孢呋辛1500 mg与脐带夹闭后产后给予）对新生儿微生物群落微生物定植的影响，直至三岁。总共纳入了40名剖宫产新生儿（20名母亲随机分配到皮肤切口前接受预防性头孢呋辛1500 mg静脉注射，20名在脐带夹闭后给予），以及23名经阴道分娩的新生儿作为对照组。经阴道分娩的新生儿在出生后28天内未接受任何抗生素治疗，其母亲在怀孕、分娩或产后28天内也未接受任何抗生素治疗。所有63名新生儿均为足月出生，在出生后28天内未接受任何抗生素或免疫抑制药物治疗。除了剖宫产期间的预防性抗生素外，纳入的母亲在怀孕、分娩或产后第一个月内未接受任何抗生素治疗。
符合条件的孕妇为正常体重胎儿，妊娠年龄超过37周且计划进行初次剖宫产。
排除标准见已发布的研究方案，也可在表1中找到[12]。为了本研究的目的，我们在分娩前24小时内额外收集了母亲的阴道和直肠拭子。该研究方案得到了科学学院自由大学医学中心研究伦理审查委员会的批准（2014.468）。所有纳入参与者的父母均签署了书面知情同意书。原始试验已在荷兰临床试验注册处注册，符合赫尔辛基宣言（试验注册号：NTR6000, https://www.trialregisternl/trial/5845），并且研究方案已在线发布[12]。
在产妇入院时，当她在分娩病房临产时，采集了阴道和直肠拭子（Copan带eNat缓冲液的绒毛拭子），并立即存放在-20°C下。对于剖宫产的妇女，在剖宫产时放置尿管时采集阴道和直肠拭子，并直接存放在-20°C下，直到进一步处理。新生儿的第一份粪便（胎粪）在出生后第0天由护士或助产士从尿布中收集在一个无菌容器（Stuhlgefäß 10mL, Frickenhausen, Germany）中，并存放在-20°C下。出生后第7天和第28天的新生儿粪便样本由父母在家用类似的容器收集。父母获得了使用提供的取样工具从尿布中舀取胎粪并立即放入容器以防止污染的指示。然后他们被指示立即关闭盖子并将样本放入冷冻室。
这些样本在常规产后检查6周后的当天以冷冻状态运送到医院，并存放在-20°C下，直到分析。图1展示了包括采样时间在内的研究概述。
新生儿第0天、第7天和第28天的粪便样本之前已用于另一项试验[9]。在本研究中，我们使用了之前测序的数据。母体阴道和直肠拭子的DNA提取和测序使用相同的协议。简而言之，使用NucliSENS easyMag（bioMérieux, Marcy l'Etoile, France）提取DNA。扩增了细菌16S rRNA基因的V3-V4高变区（341F-785R）。这些序列用于扩增子序列变异分析。使用通用引物S-D-Bact-0341-b-S-17和S-D-Bact-0785-a-A-21进行扩增。测序在Illumina MiSeq仪器（Illumina, San Diego, California, USA）上使用LifeSequencing S.L.（Valencia, Spain）提供的2×300 bp双端测序协议进行。DNA提取和测序的详细描述见之前发表的文章[9]。去复用读段使用NG-Tax管道默认参数进行过滤[13,14,15]。使用NG-Tax和SILVA数据库[16]进行分类学注释。每个样本中发现的物种数量在稀疏曲线中达到平台期（补充图1），表明样本已充分测序。我们决定不将样本稀疏化到均匀深度，因为我们旨在评估母体-新生儿配对中共享扩增子序列变异（ASVs）的存在，而将样本稀疏化到均匀深度可能会导致某些ASVs丢失。
微生物群分析包括两个部分：
评估了母体阴道和直肠拭子中ASVs的数量及其在家族水平上的相对丰度。同样，对新生儿样本（经阴道分娩和剖宫产新生儿）在三个预定义的时间点（d0, d7和d28）进行了相同的操作。在母体阴道拭子和直肠拭子中分别识别出26 (41551 reads) 和 83 (43764 reads) 个ASVs。在新生儿样本中，在第0天、第7天和第28天分别发现了总中位数为39 (reads 43522)，24 (40710 reads) 和 23 ASVs (50273 reads)。
共有63对母婴参加了本研究[12]。纳入母亲的基本特征见表2。所有新生儿均为足月出生，但经阴道分娩的新生儿孕周显著较高。此外，剖宫产新生儿的母亲年龄较大。
在经阴道分娩的新生儿中，第0天母体阴道拭子中存在并在新生儿粪便样本中发现的ASVs中位数为1%（IQR 0–41%，范围0–91%）。第7天母体阴道拭子中存在并在新生儿粪便样本中发现的ASVs中位数为0%（IQR 0–23%，范围0–79%），第28天母体阴道拭子中存在并在新生儿粪便样本中发现的ASVs中位数为0%（IQR 0–23%，范围0–73%）（图2A中的白色条形）。
在经阴道分娩的新生儿中，第0天母体直肠拭子中存在并在新生儿粪便样本中发现的ASVs中位数为2%（IQR 0–46%，范围0–81%）。第7天母体直肠拭子中存在并在新生儿粪便样本中发现的ASVs中位数为33%（IQR 5–52%，范围0–92%），第28天母体直肠拭子中存在并在新生儿粪便样本中发现的ASVs中位数为19%（IQR 2–50%，范围0–87%）（图2A中的绿色条形）。比较阴道拭子与直肠拭子在VB新生儿中共享的ASVs的相对丰度，第0天无显著差异（p = 0.902），但在第7天（p = 0.024）和第28天（p = 0.022）有显著差异。
在剖宫产新生儿中，第0天母体阴道拭子中存在并在新生儿粪便样本中发现的ASVs中位数为0%（IQR 0–3%，范围0–23%）。第7天母体阴道拭子中存在并在新生儿粪便样本中发现的ASVs中位数为0%（IQR 0–0%，范围0–53%），第28天母体阴道拭子中存在并在新生儿粪便样本中发现的ASVs中位数为0%（IQR 0–0%，范围0–43%）（图2B中的白色条形）。
在剖宫产新生儿中，第0天母体直肠拭子中存在并在新生儿粪便样本中发现的ASVs中位数为3%（IQR 0–14%，范围0–24%）。第7天母体直肠拭子中存在并在新生儿粪便样本中发现的ASVs中位数为0%（IQR 0–7%，范围0–69%），第28天母体直肠拭子中存在并在新生儿粪便样本中发现的ASVs中位数为2%（IQR 0–22%，范围0–94%）（图2B中的蓝色条形）。比较剖宫产新生儿中母体阴道与直肠样本之间共享的ASVs的相对丰度，第0天无显著差异（p = 0.394），但在第7天（p = 0.034）和第28天（p = 0.014）有显著差异。
我们观察到，新生儿与母体直肠拭子之间共享的ASVs通常来自 Bacteroides 和 Bifidobacterium 属。唯一检测到的与母体阴道拭子共享的ASVs包括 Streptococci ，这是健康个体中的阴道共生菌[17]和 Escherichia-Shigella 。
图2
a 经阴道分娩新生儿中母体阴道与直肠样本之间共享ASVs的相对丰度。第0天：阴道拭子 vs 直肠拭子 p = 0.902，第7天：阴道拭子 vs 直肠拭子 p = 0.024，第28天：阴道拭子 vs 直肠拭子 p = 0.022。星号表示显著性。b 剖宫产新生儿中母体阴道与直肠样本之间共享ASVs的相对丰度。第0天：阴道拭子 vs 直肠拭子 p = 0.394，第7天：阴道拭子 vs 直肠拭子 p = 0.034，第28天：阴道拭子 vs 直肠拭子 p = 0.014。星号表示显著性。
对于每对母婴，我们计算了母体拭子与新生儿粪便样本之间共享的ASVs的数量。考虑到分娩方式，以评估早期母体播种的过程。从共享的ASVs中，确定了母体阴道和直肠拭子以及新生儿拭子中每个ASVs的相对丰度。这在所有三个时间点都进行了。
第0天和第28天，经阴道分娩新生儿（图3A中的黄色条形）（中位数2%（IQR 0–77%，范围0–81%），中位数19%（IQR 1–60%，范围0–87%））与剖宫产新生儿（图3A中的蓝色条形）（中位数3%（IQR 0–18%，范围0–24%），中位数2%（IQR 0–24%，范围0–94%））之间与母体直肠拭子共享的ASVs在新生儿样本中的相对丰度无显著差异（第0天p值 = 0.73，第28天p值 = 0.095）。第7天有显著差异（p = 0.002），经阴道分娩新生儿（中位数33%（IQR 5–55%，范围0–92%））与剖宫产新生儿（中位数0%（IQR 0–8%，范围0–69%））之间与母体直肠拭子共享的ASVs在新生儿样本中的相对丰度有显著差异。
第0天、第7天和第28天，经阴道分娩新生儿（图3B中的黄色条形）（中位数1%（IQR 0–41%，范围0–91%），中位数0%（IQR 0–28%，范围0–79%），中位数0%（IQR 0–24%，范围0–73%））与剖宫产新生儿（图3B中的蓝色条形）（中位数0%（IQR 0–9%，范围0–23%），中位数0%（IQR 0–2%，范围0–53%），中位数0%（IQR 0–3%，范围0–43%））之间与母体阴道拭子共享的ASVs在新生儿样本中的相对丰度无显著差异（第0天p值 = 0.295，第7天p值 = 0.128，第28天p值 = 0.395）。
图3
a 母体直肠拭子与新生儿样本之间共享ASVs的相对丰度（经阴道分娩 vs 剖宫产）。第0天：p值 = 0.731，第7天：p值 = 0.002，星号表示显著性，第28天：p值 = 0.095。b 母体阴道拭子与新生儿样本之间共享ASVs的相对丰度（经阴道分娩 vs 剖宫产）。未发现显著差异。第0天：p值 = 0.295，第7天：p值 = 0.128，第28天：p值 = 0.395。
在本研究中，我们评估了母体阴道和直肠微生物群如何在经阴道分娩和剖宫产新生儿中促进新生儿胃微生物群落的早期定植。仅有一小部分母体直肠和阴道ASVs在经阴道分娩和剖宫产新生儿中从母亲传给新生儿。我们观察到分娩方式对从母亲传给新生儿的ASVs数量没有持久影响。然而，在两种分娩方式中，与母体直肠拭子共享的ASVs的相对丰度较高（经阴道分娩的婴儿为19%，剖宫产婴儿为2%），而与母体阴道拭子共享的ASVs的相对丰度在第28天均为0%。
由于新生儿微生物群落定植被认为始于分娩过程中母体微生物的垂直传播，因此预计分娩方式最初会影响这一过程[7]。然而，定植在出生后继续通过水平传播进行，这取决于多种环境因素，包括药物暴露，特别是抗生素[4,5,6]。一项比较56名新生儿（28对双胞胎）在出生后第四天内的粪便样本与其28位母亲的粪便样本的研究也报告说，在剖宫产（n = 35）和经阴道分娩（n = 21）新生儿中，母亲与新生儿之间共享的ASVs没有差异[17]。然而，关于母亲与剖宫产和经阴道分娩新生儿之间微生物共享的数据存在冲突。最近的一项研究表明，经阴道分娩新生儿的早期微生物群落定植者中有72%与母体粪便中的物种匹配，而在剖宫产新生儿中这一比例为41%[18]。这些差异至少部分可以用研究方法的不同来解释。一些研究仅包括择期剖宫产，而其他研究还包括二次剖宫产和宫颈扩张或膜破裂的情况，在这些情况下，新生儿可能已经在子宫内受到母体生殖道和胃微生物群落的垂直传播。另一个可能的解释是定植间隔的不同，这意味着剖宫产对新生儿胃微生物群落定植的影响不仅在出生后立即发生，还在产后住院期间通过医院环境中的菌株传播[11]。研究表明，母体微生物群落中的菌株在四个月大时主导着婴儿的微生物群，但随着时间的推移，菌株相似性因其他主要是水平来源的菌株替代而下降[11, 19]。
先前的工作表明，剖宫产与延迟的微生物成熟有关，以及某些细菌（如 Bacteroides , Bifidobacterium ）在婴儿微生物群落中的低流行率持续超过6个月，有些研究甚至描述这种影响可持续到两岁[9, 10, 20, 21]。此外，剖宫产出生的婴儿据报道有更多的机会性病原体，如 Enterococcus , Klebsiella 和 Firmicutes ，以及微生物群落微生物群的一般失衡[6, 22]。Zhou等人最近的工作表明，通过含有阴道液体的纱布转移阴道微生物群可以恢复剖宫产新生儿的微生物群落微生物群（n = 35），并且这些新生儿的神经发育评分明显优于对照组中使用含盐水纱布的剖宫产新生儿（n = 41）[20]。有趣的是，在最近一项包括75名新生儿的研究中，大多数剖宫产新生儿在第一周内有属于 Bacteroides 组的ASVs，而在第二周内这些ASVs不再存在。在8名婴儿中，菌株与母体直肠拭子相匹配。这种消失表明可能存在不利于 Bacteroides 生长的环境，或物种定植适应性的差异，或者存在拮抗剂（例如 Streptococcus ）[8]。与之前的数据一致，我们还观察到阴道微生物群似乎只在经阴道分娩的新生儿中轻微地转移到新生儿微生物群落[22]。可能竞争其他菌群影响了超越初始暴露的定植，或者阴道微生物在新生儿微生物群落中无法生存[8]。
无论分娩方式如何，来自母体胃微生物群落的物种在新生儿微生物群落定植中的贡献大于来自母体阴道微生物群的贡献。先前的研究显示，新生儿微生物群与母体胃微生物群落来源共享的比例在30%到70%之间[18, 19, 23, 24]。Drell等人在一项包括七名母亲（其中五人通过剖宫产分娩）的研究中观察到，母亲微生物群落微生物群与新生儿粪便微生物群之间的操作分类单元共享比例分别为48-72小时、6-8周和6个月后的32%、34%和29%[24]。在另一项招募了25名经阴道分娩女性的研究中，母亲的粪便微生物群占新生儿微生物群落总体微生物丰度的22.1%[19]。观察到的传播物种包括 Escherichia coli 、微生物群落相关的双歧杆菌属物种和 Bacteroides [19]。我们可以推测其余大部分检测到的菌株可能是通过水平而不是垂直传播积累的。
除阴道、微生物群落和皮肤外，描述为对新生儿定植有贡献的母体部位还包括舌背和母乳，通过细菌肠-乳腺途径，母体微生物群落细菌通过母乳转移到婴儿的微生物群落[22, 25]。在一项涉及7对母婴的研究中，所有母亲均经阴道分娩并纯母乳喂养，结果显示母体粪便样本、母乳和新生儿粪便中存在 Bifidobacterium breve 共享[25]。新生儿喂养类型（包括母乳和配方奶）影响定植，是一个重要的混杂因素。在我们的研究中，50%的剖宫产新生儿和65%的经阴道分娩新生儿纯母乳喂养。在剖宫产组中，23%仅接受配方奶，28%接受母乳和配方奶的组合。在经阴道分娩组中，17%仅接受配方奶，17%接受母乳和配方奶的组合。其他研究表明，产后直接的微生物物种水平传播来源包括医院人员（对于剖宫产新生儿）和家庭成员（如父亲和兄弟姐妹以及宠物）的菌株、环境（皮肤、瓶子、衣物、床垫）和营养[19]。家庭成员之间的菌株共享以前已有描述，在2至10岁之间达到高峰，并且双胞胎和非双胞胎兄弟姐妹之间相似（排除特定遗传成分）。重要的是，父亲引入了最多的共享新菌株[11]。
本研究的优点包括严格的入选标准和研究方案，考虑了已知对微生物群有影响的混杂因素，如抗生素的使用。局限性包括平均共享的母体微生物群可能被低估，尤其是在第0天，因为我们在收集和分析新生儿粪便样本时遇到了挑战，由于胎粪的一致性难以取样。我们研究的另一个局限性可能是使用了之前测序的数据。这些序列用于扩增子序列变异分析和分类学注释，但由于序列过短，只能分类到科水平。未来关于定植的研究应收集其他身体部位的母体样本。此外，虽然新生儿喂养类型（母乳或配方奶）是一个可能的局限性，因为它会影响定植，但在我们的研究中，这一混杂因素在两组中均适用。
我们观察到，母体阴道和直肠微生物群中只有少数ASVs转移到新生儿微生物群落。无论经阴道分娩还是剖宫产，新生儿一个月大时，来自母体直肠微生物群的ASVs的相对丰度高于来自阴道微生物群的ASVs的相对丰度。需要进行更多的研究来分析28天后的定植情况以及其他身体部位对定植的影响。深入了解这些机制可能有助于开发新的基于微生物群的策略，以预防或恢复早期生态失调，从而避免长期的不良健康后果。
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